Μελέτη καινοτόμων ενζύμων για την αποδοτική αποικοδόμηση της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας

Abstract

Η αποδόμηση της μη βρώσιμης λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας έχει αναδειχθεί τα τελευταία χρόνια ως μια σημαντική ευκαιρία για παραγωγή βιοενέργειας και βιοχημικών προϊόντων μέσω των βιοδιυλιστηρίων. Η ιδέα του βιοδιυλιστηρίου αποτελεί την πλέον φιλική προς το περιβάλλον μέθοδο παραγωγής βιοκαυσίμων με στόχο την προώθηση της χρήσης ανανεώσιμων πρώτων υλών για τη μείωση των περιβαλλοντικών επιπτώσεων που προκαλούνται από την αλόγιστη χρήση των υδρογονανθράκων. Για την ευρεία εκμετάλλευση της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας είναι αναπόδραστη ανάγκη η κατάλληλη αξιοποίηση διάφορων μικροοργανισμών και βιοκαταλυτών. Το βιοδιυλιστήριο λιγνινοκυτταρίνης ενσωματώνει τις έννοιες της αειφορίας, της οικολογικής συνείδησης και της αξιοποίησης πράσινων τεχνολογιών για τη μείωση, επαναχρησιμοποίηση και ανακύκλωση της βιομάζας. Επομένως, ευθυγραμμίζεται πλήρως με τις αρχές της κυκλικής βιοοικονομίας, ενός νέου μοντέλου οικονομίας που συνδυάζει τη βιοοικονομία με μια κυκλική οικονομία που βασίζεται σε ανανεώσιμες πηγές, αποσκοπώντας στην προστασία του περιβάλλοντος και την εξασφάλιση της οικονομικής βιωσιμότητας. Στο πλαίσιο αυτό, η παρούσα εργασία επικεντρώθηκε στην ενζυμική αποικοδόμηση της ημικυτταρίνης της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας. Πιο συγκεκριμένα, μελετήθηκαν δύο καινοτόμα ένζυμα και συγκεκριμένα μια αραβινοφουρανοζιδάση της οικογένειας των γλυκοζιδικών υδρολασών GH43 (ΤtAbf43) και μια εστεράση, η οποία ανήκει στην οικογένεια των εστερασών CE16 του οξικού οξέος (TtCE16) από το μύκητα Thermothelomyces thermophilus, τα οποία εμπλέκονται στην αποικοδόμηση της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας. Αρχικά, έγινε βιοχημικός χαρακτηρισμός των δύο ενζύμων και σε δεύτερη φάση μελετήθηκε η συνεργιστική δράση των δύο αυτών ενζύμων με άλλα ημικυτταρινολυτικά ένζυμα (ξυλανάσες, αραβινοφουρανοζιδάσες, εστεράσες) με στόχο την καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού δράσης τους. Ειδικότερα, όσον αφορά την αραβινοφουρανοζιδάση ΤtAbf43, προσδιορίστηκε η ενζυμική της ενεργότητα σε υπόστρωμα αραβινάνης, όπου βρέθηκε 21±2 U/mg, καθώς και οι κινητικές σταθερές Michaelis-Menten (Vmax, KM) σε υπόστρωμα αραβινάνης σκοπό να διερευνηθεί η συγγένεια ενζύμου-υποστρώματος. Στην αραβινάνη σημειώθηκαν Vmax=0.18±0.01 mg/ml/min και KM=109±13 mg/ml, τιμές που υποδηλώνουν χαμηλή συγγένεια ενζύμου-υποστρώματος. Επιπλέον, εξετάστηκε η συνδυαστική της δράση με τις εμπορικές αραβινοφουρανοζιδάσες E-AFASE και E-AFAM2 σε αραβινοξυλάνη σιταριού (WA) και αραβινοξυλάνη σίκαλης (RA). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και στα δύο υποστρώματα η TtAb43 παρουσίασε παρόμοιο τρόπο δράσης με την E-AFAM2 και συμπληρωματικό τρόπο δράσης με την E-AFASE, άρα θεωρείται πως το ένζυμο κόβει τη μία αραβινόζη από διπλά υποκατεστημένα μόρια ξυλόζης. Οι βαθμοί συνεργιτισμού που σημειώθηκαν κατά τη συνδυαστική δράση της ΤtAbf43 με την εμπορική αραβινοφουρανοζιδάση E-AFASE (1.57±0.09 με υπόστρωμα το WA και 1.18±0.17 με υπόστρωμα το RA) υποδεικνύουν συνεργιτισμό, αναδεικνύοντας την αναγκαιότητα της συνδυασμένης αξιοποίησής τους για την αποδοτική υδρόλυση βιομάζας. Κατόπιν, διεξήχθη ο βιοχημικός χαρακτηρισμός της εστεράσης του οξικού οξέος TtCE16. To ένζυμο παρουσίασε ειδική ενεργότητα 587±35 U/mg σε υπόστρωμα p-NP Acetate, 107±7 U/mg σε o-NP Acetate, 2.6±0.6 U/mg σε p-NP Butyrate και 11.0±2.3 U/mg σε p-NP Palmitate και με την πραγματοποίηση κινητικής Michaelis-Menten προσδιορίστηκε η σταθερά ΚΜ, που προέκυψε 0.09 ± 0.01 mM σε p-NP Acetate και υποδηλώνει υψηλή συγγένεια ενζύμου-υποστρώματος. Η βέλτιστη θερμοκρασία δράσης του ενζύμου είναι οι 60 οC, ενώ διατηρεί υψηλή ενεργότητα σε ένα εύρος θερμοκρασιών 45-70 οC. Η εστεράση διατηρεί την ενεργότητά της κατόπιν εικοσιτετράωρης επώασης σε ήπιες θερμοκρασίες, ενώ αδρανοποιείται πάνω από τους 50 οC και είναι ιδιαιτέρως σταθερή σε ένα εύρος pH 3-9. Ο μηχανισμός δράσης του ενζύμου προσεγγίστηκε κατόπιν συγκριτικής μελέτης με εστεράσες του οξικού οξέος γνωστής εξειδίκευσης που ανήκουν στις οικογένειες CE2 και CE6 ως προς το υπόστρωμα ακετυλιωμένης ξυλάνης, που είχε επεξεργαστεί με ξυλανάσες των οικογενειών GH10 (E-XYLATM) και GH11 (E-XYΑΝ4). H ποσοστιαία απελευθέρωση οξικού οξέος (116±7% και 95±7% με τις E-XYLATM και E-XYΑΝ4 αντίστοιχα) στα δείγματα που περιείχαν το συνδυασμό TtCE16-OCE6, οδηγεί στην υπόθεση περί συμπληρωματικής δράσης των δύο ενζύμων, ενώ η παρόμοια δράση που εμφάνισε με την εστεράση CtCE2, οδηγεί στην υπόθεση ότι το μελετώμενο ένζυμο κόβει ακετυλυώσεις από τις θέσεις 2-3-4 και διπλές υποκαταστάσεις από ξυλο-ολιγοσακχαρίτες. Κατόπιν, μελετήθηκε η συνεργιστική δράση της E-XYLATM με τις εστεράσες TtCE16 και ΟCE6 σε υπόστρωμα προκατεργασμένου ξύλου οξιάς ( ΠΞΟ), με τη μεγαλύτερη απελευθέρωση οξικού οξέος να παρατηρείται κατά το συνδυασμό TtCE16-OCE6-E-XYLATM, ενώ κατά το συνδυασμό αυτό και η συγκέντρωση του ουρονικού UXOS παρουσίασε μια αυξητική τάση (186±11%). Έπειτα, διερευνήθηκε η συνεργιστική δράσης της ξυλανάσης TtXyn30A με τις εστεράσες TtCE16, CtCE2 και ΟCE6 σε ακετυλιωμένη ξυλάνη και σε ΠΞΟ. Όσον αφορά το υπόστρωμα ακετυλιωμένης ξυλάνης, ο συνδυασμός TtCE16- TtXyn30A οδήγησε σε αύξηση ξυλοβιόζης κατά 21±2%, που όμως υστερούσε σημαντικά της αύξησης που παρατηρήθηκε με το του συνδυασμό TtXyn30A-ΟCE6, γεγονός αναμενόμενο αφού η ΤtCE16 επί της ουσίας δρα στα προϊόντα της GH30. Όσον αφορά το υπόστρωμα ΠΞΟ, δε σημειώθηκε αύξηση των σακχάρων Χ1 και Χ2, ενώ μηδενική αύξηση παρατηρήθηκε και στην απελευθέρωση του ουρονικού ολιγοσακχαρίτη O-XUX με την συνεργιστική δράση των ενζύμων TtXyn30A-TtCE16 με αποτέλεσμα ο συνδυασμός της μελετώμενης εστεράσης με την ξυλανάση TtXyn30A να θεωρείται αναποτελεσματικός για την υδρόλυση του ΠΞΟ. Τέλος, εξετάστηκε η επίδραση της α-γλυκουρονιδάσης E-AGUBS στα προϊόντα υδρόλυσης της TtXyn30A σε υπόστρωμα ΠΞΟ και πιο συγκεκριμένα στο Ο-UX (22-(4-O-Methyl-α-D-Glucuronyl)-xylobiose). Βρέθηκε ότι η γλυκουρονισάση παρεμποδίζεται κατά τη διάσπαση του Ο-UX, γεγονος που πιθανότατα οφείλεται σε ακετυλίωση στη θέση 3 της ξυλόζης που φέρει το ουρονικό, με το αποτέλεσμα αυτό να χρήζει περεταίρω διερεύνησης. Συμπερασματικά, στην παρούσα εργασία αναδείχθηκε η σημασία των βοηθητικών ενζύμων, τόσο ως προς τον συνεργιτισμό με τις ξυλανάσες όσο και ως προς τη συμπληρωματική δράση με ένζυμα της ίδιας ενεργότητας αλλά διαφορετικής εξειδίκευσης. Κατά συνέπεια, συμβάλλει στο να ανοίξουν νέοι ορίζοντες στην έρευνα για την αποδοτική αποικοδόμηση της βιομάζας.